Identification du tissu tumoral dans des échantillons pathologiques minces par laser femtoseconde

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9250 (2023) Citer cet article

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Dans le traitement de la plupart des tumeurs cancéreuses solides nouvellement découvertes, la chirurgie reste la première option de traitement. Un facteur important dans la réussite de ces opérations est l'identification précise des marges de sécurité oncologiques pour assurer l'ablation complète de la tumeur sans affecter une grande partie des tissus sains voisins. Nous rapportons ici la possibilité d'appliquer la spectroscopie de répartition induite par laser femtoseconde (LIBS) combinée à des algorithmes d'apprentissage automatique comme technique de discrimination alternative pour différencier les tissus cancéreux. Les spectres d'émission après l'ablation sur des échantillons postopératoires fins de foie et de sein fixés ont été enregistrés avec une résolution spatiale élevée ; les sections colorées adjacentes ont servi de référence pour l'identification des tissus par analyse pathologique classique. Dans un test de preuve de principe effectué sur du tissu hépatique, les algorithmes de réseaux de neurones artificiels et de forêts aléatoires ont pu différencier les tissus sains et tumoraux avec une précision de classification très élevée d'environ 0,95. La capacité d'identifier des tissus inconnus a été réalisée sur des échantillons de sein de différentes patientes, offrant également un niveau élevé de discrimination. Nos résultats montrent que le LIBS avec des lasers femtosecondes est une technique susceptible d'être utilisée dans des applications cliniques pour l'identification rapide du type de tissu dans le champ chirurgical peropératoire.

La chirurgie reste la principale ligne d'attaque pour éradiquer le cancer découvert à ses débuts. La plupart des tumeurs solides nouvellement diagnostiquées sont enlevées par chirurgie, dans l'espoir d'une guérison complète ou au moins de prolonger l'espérance de vie du patient1. Les cellules cancéreuses laissées après l'opération (par exemple, par des marges positives de l'échantillon de résection) peuvent générer des récidives locales ou des métastases au fil du temps, étant l'un des facteurs clés déterminant le taux de survie d'un patient. Dans de nombreux cas, des interventions chirurgicales ultérieures sont nécessaires pour retirer le tissu néoplasique nouvellement formé, ou des thérapies adjuvantes (radiothérapie ou chimiothérapie) sont nécessaires, qui ont de nombreux effets secondaires. Les résultats de la chirurgie sont principalement déterminés par l'expérience de l'équipe médicale effectuant l'intervention oncologique : le but est d'éliminer complètement les cellules malignes (pour prévenir de nouvelles récidives) et de préserver le plus possible de tissu de l'organe affecté, sans dégrader sa fonctionnalité. En pratique, les marges de sécurité oncologiques varient entre 2 mm et 1 cm, selon le type de cancer et la localisation de la tumeur2. La localisation de haute précision de la tumeur est d'une importance cruciale pour le succès de l'opération. L'équipe chirurgicale peut utiliser les informations obtenues avant l'opération à partir des techniques d'imagerie (tomographie par résonance magnétique, tomodensitométrie par rayons X ou imagerie par ultrasons), mais dans le domaine opératoire, les décisions sont principalement basées sur des informations visuelles et tactiles. Plusieurs fois, pour décider si le tissu malin a été complètement retiré, l'examen pathologique peropératoire sur un échantillon congelé est utilisé. Cette procédure nécessite plusieurs dizaines de minutes et, en cas d'incertitude, augmenterait significativement le temps opératoire, augmentant le risque de complications. Pour cette raison, une technique alternative ou complémentaire avec un établissement rapide et précis du type de tissu opéré est hautement souhaitable.

Ces dernières années, plusieurs techniques innovantes ont été étudiées pour l'analyse in vivo. Les techniques de spectroscopie de masse, dans lesquelles les valeurs de masse/charge sont mesurées pour différents fragments moléculaires résultant de la décomposition locale du tissu, ont déjà été testées in vivo pour identifier différents types de cancer3,4,5. Parallèlement à cela, des techniques optiques, telles que la tomographie par cohérence optique6,7, la spectroscopie Raman8,9,10 et la spectroscopie à claquage induit par laser (LIBS), ont été étudiées en raison de leur portabilité et de leur grande précision spatiale. Même si les premières tentatives d'utilisation du LIBS pour détecter les tissus cancéreux remontent à près de deux décennies11, le développement ces dernières années d'algorithmes de Machine Learning (ML) permettant d'interpréter un grand volume de données expérimentales a intensifié ces études12. La technique LIBS analyse les spectres d'émission du plasma créé par des lasers focalisés sur la surface des matériaux. Il a l'avantage de produire des résultats rapides sur une grande variété d'échantillons qui ne nécessitent pas de prétraitement compliqué. Dans le procédé LIBS, le matériau est ionisé et un plasma est produit qui, lors du refroidissement, émettra un rayonnement spécifique aux éléments chimiques présents dans le matériau. De nombreuses études qui tentent d'identifier différents types de tissus malins sont réalisées à l'aide de lasers nanosecondes12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22, produisant un plasma à haute température avec des dommages thermiques importants à l'échantillon et une diminution de la résolution spatiale23. Dans des études précédentes, nous avons montré que les impulsions femtosecondes (fs) peuvent être utilisées pour une analyse LIBS de précision in situ/in vivo de tissus biologiques23 et d'échantillons techniques24, permettant une résolution spatiale de l'ordre du micron et inférieure à 25. Les applications de fs-LIBS sur différents tissus biologiques sont présentées dans plusieurs études (Réf.26 et références), mais son utilisation dans la détection de tissus cancéreux a été moins étudiée12,27,28,29.

Cet article présente nos résultats dans l'identification du cancer du foie et du sein dans des échantillons pathologiques humains standard à l'aide d'algorithmes fs-LIBS et ML. En utilisant les avantages des impulsions laser ultracourtes, nous avons pu enregistrer des spectres d'émission atomiques et moléculaires après ablation sur des échantillons très fins avec des épaisseurs de quelques microns. Le type de tissu d'où provient le spectre enregistré (utilisé dans la formation et l'évaluation des algorithmes ML) pourrait être identifié par comparaison directe avec les résultats de l'analyse pathologique sur les coupes adjacentes. À notre connaissance, ce type d'analyse sur des échantillons d'épaisseur micrométrique n'a été effectué que dans une étude récente sur le tissu tumoral gastro-intestinal en utilisant des impulsions laser ns22, mais les spectres présentés dans cette publication ont une forte contribution spectrale du substrat, avec de nombreuses raies d'émission se chevauchant avec celles provenant du tissu biologique. En utilisant des impulsions laser ultracourtes et un substrat de quartz de haute pureté, nous avons effectué une ablation avec une résolution spatiale élevée et de faibles dommages collatéraux, et les spectres enregistrés ne contiennent que des contributions de l'échantillon.

Le document est structuré comme suit : la section suivante présente la procédure expérimentale et les informations sur la préparation des échantillons. Ensuite, fs-LIBS et ML sont testés avec du tissu hépatique pour observer si les spectres obtenus à partir d'échantillons pathologiques très fins peuvent être utilisés pour identifier le type de tissu. De plus, dans cette section, la reproductibilité des mesures est étudiée par des comparaisons entre les données enregistrées à différents jours. La dernière section présente les résultats obtenus à partir du cancer du sein et comment les algorithmes déjà entraînés sur certains patients peuvent être utilisés pour détecter des cellules cancéreuses chez un patient différent.

Des impulsions laser d'une largeur temporelle de 30 fs à une longueur d'onde centrale de 785 nm et un taux de répétition de 1 kHz ont été générées par un système laser Ti:Sapphire amplifié (Femtolasers, Femtopower Pro). Le taux de répétition est réduit à un seul coup en utilisant la cellule de Pockels (comme sélecteur d'impulsion électro-optique) à l'intérieur de l'amplificateur. La lumière polarisée linéairement a été guidée vers un formateur d'impulsions de haute précision, où la dispersion globale des éléments optiques jusqu'à la surface de l'échantillon a été compensée à l'aide d'un signal de photodiode à deux photons comme rétroaction. Entre le système laser et la plateforme du microscope, nous avons plusieurs composants optiques pour faire varier et enregistrer l'énergie des impulsions. La figure 1 montre un diagramme schématique de la configuration fs-LIBS utilisée dans cette étude. Les principaux composants de la plate-forme du microscope sont une caméra de surveillance pour le positionnement de l'échantillon, une platine de translation XYZ contrôlée par moteur pas à pas (PI miCos) et une platine d'inclinaison pour rendre la surface de l'échantillon parallèle aux directions de mouvement x et y de la platine. Un objectif Mitutoyo Plan Apo 10X avec une ouverture numérique (NA) de 0,28 et une distance de travail de 34 mm focalise les impulsions laser sur un rayon de faisceau mesuré de 3,5 µm (à \(1/{e}^{2}\) d'intensité) sur l'échantillon. Avec une plage de Rayleigh inférieure à 12 µm, le plasma est créé sur l'échantillon biologique fin, produisant une ablation minimale à partir du matériau du substrat. Les mesures ont été effectuées à température ambiante dans l'atmosphère de l'air, en utilisant une énergie par impulsion de \(7\pm 0,5 \mu \mathrm{J}\) et une intensité maximale correspondante d'environ \(5\times {10}^{14}\mathrm{ W}/{\mathrm{cm}}^{2}\), ce qui assure un bon rapport signal sur bruit avec une très faible contribution spectrale du substrat.

Représentation schématique du montage expérimental.

Pour chaque emplacement sélectionné sur l'échantillon avec un type de tissu pré-identifié, nous avons ablaté une matrice 10 × 10 dans un régime à un seul coup du laser ; après l'enregistrement du spectre du plasma créé par chaque impulsion laser, l'échantillon a été déplacé d'une distance spot à spot de 25 µm.

La lumière émise par le plasma induit par laser a été collectée à une NA de 0,22 par un système de deux lentilles en silice fondue positionnées à 45° près de l'objectif du microscope et transportées à travers une fibre optique jusqu'à la fente d'entrée de 50 µm du spectromètre (LOT Oriel Multispec MS125). Pour cette expérience, nous avons utilisé un réseau à 400 traits/mm et 500 nm blaze (LOT Oriel 77417), qui assurait une résolution spectrale d'environ 1 nm. Un Roper Scientific PIMAX ICCD intensifié a été fixé au spectromètre pour enregistrer les spectres. L'étalonnage de la longueur d'onde a été effectué avec une lampe d'étalonnage (LOT Oriel Pen Ray 6035 Hg(Ar)) sans étalonnage de l'intensité.

L'acquisition des données a été synchronisée avec le système laser. Le générateur de synchronisation programmable de la caméra contrôle le retard et le temps d'exposition (gate) de l'enregistrement avec une précision ns. Pour l'émission fs-LIBS, nous avons utilisé un délai de 23 ns après l'impulsion laser et un temps de porte de 500 ns pour supprimer l'émission supercontinuum de l'impulsion laser et le fond large bande du continuum bremsstrahlung. Chaque spectre a été enregistré et étiqueté en fonction du type de tissu.

Des échantillons de tissus fixés au formol et inclus en paraffine de foie humain contenant une métastase de cancer colorectal, de tissu mammaire avec une tumeur primaire, ainsi qu'un ganglion lymphatique avec un cancer du sein métastatique ont été étudiés. Des coupes minces en série de 10 µm ont été préparées à partir de chaque bloc de paraffine à l'aide d'un microtome et la paraffine a été éliminée en la dissolvant ensuite avec du xylène, de l'alcool et de l'eau selon les protocoles standard32. Les tranches les plus externes de la pile ont été colorées avec un protocole standard H&E (hématoxyline et éosine) pour identifier les régions de tissus sains et cancéreux (Fig. 2a). De cette façon, chaque ensemble de deux ou trois diapositives LIBS a été encapsulé par une paire de diapositives de référence et nous pouvons utiliser l'analyse pathologique classique par inspection optique sur les tranches externes colorées pour sélectionner les emplacements correspondants sur les tranches internes pour une enquête spectrale avec une grande certitude. Les tranches de dimensions latérales d'environ 2 × 1,5 cm ont été placées sur une lame de microscopie. Dans l'analyse LIBS sur des échantillons très fins, un problème important est le choix du substrat28, qui peut présenter de fortes raies spectrales d'impuretés22. Pour cette raison, nous avons choisi des substrats en verre de quartz de haute pureté (Plano GmbH), où les seules raies d'émission présentes dans la gamme spectrale mesurée sont celles du silicium (Si), comme on peut le voir dans l'insertion de la Fig. 3. Comme le silicium est présent en quantités négligeables dans les tissus biologiques du sein et du foie analysés33,34, nous avons supprimé les spectres avec des signaux Si significatifs car ceux-ci ne peuvent provenir que du substrat. Une autre façon d'éviter les problèmes de substrat (et d'obtenir des signaux plus élevés) serait des tranches plus épaisses, mais elles sont difficiles à obtenir et à manipuler par cette procédure.

Représentation schématique de la préparation des échantillons en (a) et images microscopiques des deux types de tissus (foie en (b) et sein en (c)). Les marques rouges en (b) et (c) indiquent des régions tumorales pures, tandis que les marques bleues indiquent des régions saines et pures. Les zones restantes contiennent un mélange de cellules tumorales et saines. L'encart en (b) montre l'image d'une matrice ablatée superposée à la zone correspondante dans l'image de référence.

Spectres hépatiques prétraités (soustraction de base et normalisation vectorielle) des deux classes (rouge = "Tumeur", bleu = "Sain", y compris la distribution respective du signal de chaque longueur d'onde dans l'ensemble de données indiqué par les nuances de couleur correspondantes. L'insertion en haut à gauche montre une moyenne de 100 spectres enregistrés à partir du substrat vide (quartz, vert) et du tissu hépatique tumoral (rouge) et celui en haut à droite montre une partie agrandie du spectre pour une meilleure visualisation de la ligne Na.

Le tableau 1 présente pour chaque patient le nombre d'échantillons LIBS et le nombre total de spectres enregistrés dans les zones tumorales et saines. Les échantillons du patient 3 ne sont que du tissu tumoral mammaire développé dans les ganglions lymphatiques (pas de tissu mammaire sain).

La figure 2 montre des images de deux lames de référence provenant des deux types de tissus (foie et sein). Les régions tumorales sont représentées par une couleur violet foncé (Fig. 2b et c, zone marquée en rouge), tandis que les régions saines sont indiquées par une couleur plus claire (Fig. 2b et c, zone marquée en bleu). Les mesures spectrales ont été limitées aux zones marquées pour assurer l'identification et l'étiquetage corrects du type de tissu.

Les spectres résultants sont étiquetés avec la classe correspondante ("Tumor" ou "Healthy") pour une analyse ultérieure. Pour éviter les biais (pendant ML) en fonction des conditions expérimentales, un nombre comparable de spectres de chaque type de tissu a été enregistré au cours de chaque session expérimentale. Dans notre approche, le ML est une classification binaire et son objectif est de trier des spectres donnés dans les classes "Tumeur" et "Sain". Il faut mentionner que toute différenciation des stades tumoraux n'est pas considérée lors de l'évaluation. La classe "Sain" ne concerne pas non plus le type de tissu ou les types de cellules, mais uniquement l'absence de cellules tumorales. Le traitement des spectres et l'analyse par des algorithmes ML ont été effectués via l'application logicielle d'exploration de données, Orange version 3.32.035.

Des échantillons de tissus fixés au formol et inclus en paraffine de foie humain contenant une métastase de cancer colorectal, du tissu mammaire avec une tumeur primaire, ainsi qu'un ganglion lymphatique avec un cancer du sein métastatique ont été extraits des archives de l'Institut de pathologie Nordhessen (Allemagne) conformément à un vote du comité d'éthique pour la recherche scientifique (fourni par Hessische Landesärztekammer, FF61/2014). Conformément à ce vote approuvé, nous avons utilisé des échantillons de tissus non vitaux âgés de plus de 10 ans comprenant un excès de matériel qui n'est plus pertinent pour le diagnostic. Dans de tels cas, le consentement éclairé d'un patient supplémentaire n'est pas nécessaire.

Dans un premier temps, la formation et les tests de l'algorithme ML sont limités aux spectres d'échantillons de foie. Ils comprennent de vastes zones de tumeurs et de tissus sains, ce qui donne une grande certitude pour identifier et étiqueter correctement les spectres enregistrés. Cela donne une base de référence pour la performance de notre méthode proposée avant d'étendre l'analyse à des cas plus complexes.

Une séquence d'étapes de prétraitement a préparé les données acquises pour l'analyse ultérieure. Dans un premier temps, les spectres inadaptés ont été triés à l'aide du widget "the local outlier factor" du logiciel Orange qui mesure l'écart local d'un spectre enregistré donné par rapport à ses voisins (nous avons utilisé un facteur de contamination de 5% pour 25 voisins). De plus, les spectres contenant une forte raie spectrale Si I à 288,34 nm indiquent que les impulsions laser ablaient également le substrat de silice fondue et tous les spectres contenant à cette longueur d'onde un signal supérieur au fond plus les fluctuations de bruit aléatoire maximales pour cette gamme spectrale ont également été supprimés. Pour les données restantes, trois spectres adjacents ont été moyennés, réduisant ainsi l'ensemble de données d'un tiers. La soustraction de base et la normalisation vectorielle des spectres36 ont été appliquées pour corriger les écarts mineurs par rapport au processus d'enregistrement, comme les fluctuations de l'énergie des impulsions laser. La gamme complète des 1024 pixels natifs de l'ICCD n'a pas été utilisée, mais 30 d'entre eux à chaque extrémité ont été supprimés en raison d'un vignettage aux coins du capteur CCD. Enfin, l'ensemble de données sur le foie contenait un total de 2 392 spectres moyennés étiquetés comme « Tumeur » et 2 544 comme « Sains » avec 964 caractéristiques (pixels qui correspondent aux longueurs d'onde dans les spectres enregistrés).

Les spectres d'émission induits par laser enregistrés pour les deux classes sont présentés à la Fig. 3. Ils affichent des raies atomiques37 ainsi que des bandes moléculaires38. Les raies et bandes identifiées concordent avec les spectres d'émission des tissus biologiques présentés dans d'autres publications15,16,38,39. Il convient de mentionner que dans le cas de fs-LIBS, les raies d'émission moléculaire sont plus fortes que dans le cas d'impulsions ns, comme d'autres auteurs l'ont également souligné27,28, et que la nature de ces bandes est la fragmentation des molécules organiques et non la réaction du carbone avec l'azote dans l'atmosphère ambiante du laboratoire, comme indiqué dans la réf.40. La double raie Ca II à 396,8 nm et 393,4 nm est la seule contribution ionique dans le spectre. Une différence visible dans les spectres (illustrée à la Fig. 3) entre les deux catégories est le rapport d'intensité de la ligne Na, mais la discrimination uniquement sur cette ligne n'est pas aussi précise que l'utilisation d'algorithmes ML prenant en compte toutes les informations spectrales, qui peuvent l'identifier plus en détail et fournir une meilleure classification.

L'évaluation suivante de différents algorithmes ML a été réalisée avec la norme de validation croisée décuplé sur l'ensemble de données sur le foie. La performance des algorithmes est jugée par leur capacité à détecter chaque classe séparément et le pourcentage global de décisions correctes, à savoir la précision de classification (CA).

Plusieurs algorithmes de complexité et de structures différentes ont été choisis pour analyser les données : naïve Bayes, Decision Tree, Support Vector Machine, K-Nearest Neighbors, Random Forest et Neural Networks. Leur score CA est supérieur à 0,85 et indique une très bonne capacité de tous les modèles à discriminer avec précision les classes tissulaires. Les trois premiers algorithmes, à savoir les réseaux de neurones artificiels (ANN), Random Forest (RF) et K-Nearest Neighbor (KNN), ont été adaptés de manière optimale à l'ensemble de données en ajustant leurs paramètres internes pour obtenir le pourcentage le plus élevé de classification correcte. Pour ANN, nous avons utilisé 512 neurones dans une couche cachée, 250 arbres en RF et 25 voisins pour KNN. Les résultats des algorithmes entraînés sont résumés à la Fig. 4, où les diagrammes à barres représentent le pourcentage de la classification correcte. Les modèles ANN et RF peuvent détecter les deux classes au même niveau (ayant un score CA ~ 0,95), tandis que le KNN est plus sensible aux tumeurs (score CA 0,88).

Pourcentages de classifications correctes à l'aide des réseaux de neurones artificiels, de la forêt aléatoire et du voisin le plus proche K pour les tissus tumoraux et hépatiques sains.

Les spectres présentés montrent des caractéristiques distinctes, soulevant la question de savoir quelles caractéristiques (longueurs d'onde) sont pertinentes pour les décisions de l'algorithme. Cette section montrera l'analyse de l'importance des raies spectrales pour la discrimination.

Une approche simple pour cette tâche consiste à inverser un algorithme de manière à ce qu'il utilise la classe ("Tumor" ou "Healthy") comme entrée et calcule un "spectre inverse", où l'intensité de chaque ligne décrit l'importance de la décision de l'algorithme. La RF et sa structure basée sur l'arbre de décision permettent le calcul d'un tel "spectre inverse" via la diminution moyenne des impuretés pour tous les arbres (en fait, quelle est la qualité de l'ensemble de données mappé sur chaque classe pour chaque arbre et chaque longueur d'onde)41. La figure 5 affiche les résultats du calcul. Il est visible que le "spectre inverse" ressemble à ceux enregistrés, bien que les intensités des raies spectrales diffèrent considérablement. La ligne de sodium a la plus haute importance pour le processus de décision de l'algorithme, ce qui est attendu, car ses intensités divergentes ont été observées dans les spectres enregistrés. L'augmentation de l'émission de la raie Na dans le tissu tumoral a également été discutée dans d'autres publications16,17 et a été attribuée à l'augmentation intracellulaire de Na résultant d'un changement de la cinétique Na+/H+ dans un environnement extracellulaire acide. La bande C–N a le deuxième score le plus élevé et les deuxièmes intensités les plus élevées dans les spectres réels et, avec les bandes C–C, affiche l'importance des signaux moléculaires pour la prise de décision. Cependant, il est essentiel de mentionner que ces observations ne s'appliquent qu'au modèle RF et ne sont pas nécessairement applicables aux autres modèles. Néanmoins, il donne un aperçu du processus de prise de décision et montre que les algorithmes utilisent des lignes spectrales pour identifier les classes.

Le spectre inverse (score d'importance pour chaque longueur d'onde) de l'algorithme Random Forest chevauchait les spectres d'émission moyens enregistrés pour la tumeur du foie.

Nous soulignons que l'utilisation d'impulsions ultracourtes dans LIBS permet également l'utilisation de bandes d'émission moléculaire dans l'analyse, contrairement à ns-LIBS, où la différenciation est principalement basée sur des raies atomiques et ioniques. Réduire la dimensionnalité des spectres42 en utilisant comme entrée dans ML différentes combinaisons de lignes atomiques ou de bandes moléculaires génère un CA inférieur à l'utilisation de l'ensemble des informations spectrales (résultats hors de la portée de ce travail), donc notre test se concentrera sur de meilleures classifications.

Après avoir observé la capacité des algorithmes ML à identifier avec précision les tissus tumoraux et prouvé que la prise de décision est basée sur des raies spectrales d'importance variable, l'étape suivante consiste à étudier la reproductibilité de fs-LIBS et à vérifier son application en tant qu'outil analytique. Les processus d'ablation sont complexes et sensibles à divers paramètres externes. Cette complexité est encore accrue pour les investigations LIBS sur les tissus biologiques, car sa composition élémentaire est très hétérogène. Pour éviter ce problème, dans de nombreuses études, de larges foyers sont utilisés pour l'irradiation, réduisant ainsi la résolution spatiale et augmentant les dommages collatéraux13,43,44,45, ou ils utilisent un grand nombre de spectres pour la moyenne14,15,18. Fs-LIBS a l'avantage d'enregistrer des spectres plus reproductibles par rapport au ns-LIBS traditionnel en raison de sa nature déterministe d'ionisation et de l'absence d'interaction laser-plasma pendant l'impulsion laser. L'aspect de reproductibilité et de cohérence de l'ensemble de données est abordé dans ce qui suit : sur le même échantillon de tissu hépatique, nous avons effectué des mesures sur trois jours différents où nous avons optimisé la configuration pour chaque jour individuellement. Par conséquent, les spectres devraient idéalement être les mêmes, en supposant que chaque matériau ablaté dans un type de tissu contient la même composition élémentaire. Par conséquent, l'entraînement des algorithmes ML sur les spectres enregistrés en un jour tout en les testant sur ceux d'un autre jour devrait donner les mêmes résultats. Ainsi, les trois modèles optimisés, KNN, RF et ANN, ont été testés pour toutes les combinaisons possibles des trois sous-ensembles de spectres quotidiens. Tous ces algorithmes montrent une bonne reproductibilité au jour le jour, avec des pourcentages de classification correcte supérieurs à 75 % et dans ce qui suit, nous discuterons des résultats obtenus en utilisant la RF. La figure 6 affiche les prédictions correctes pour les classes Tumeur et Sain à l'aide de l'algorithme RF.

Reproductibilité des mesures sur tissu hépatique. Pourcentage de classifications correctes lorsque l'algorithme Random Forest a été formé en un jour et testé sur les données mesurées un autre jour.

Les différentes barres affichent un écart visible des performances de l'algorithme. Par exemple, la capacité RF à détecter les tissus tumoraux varie d'environ 20 %. Cependant, des écarts sont à prévoir car de nombreux facteurs, tels que des ajustements légèrement différents de la configuration et l'inhomogénéité du tissu biologique, auront un impact sur les performances des modèles. En outre, le modèle peut identifier avec précision chaque classe avec des pourcentages supérieurs à 75 % et des scores CA cohérents (non illustrés ici) supérieurs à 0,8. 8, indiquant la cohérence au sein de l'ensemble de données.

Le tissu mammaire est l'un des plus hétérogènes46. Sur les échantillons pathologiques que nous avons analysés, les zones avec une identification claire de la tumeur et du tissu sain étaient plus petites que dans le cas du tissu hépatique (comme le montre la Fig. 2). Cela a rendu la procédure de mesure plus difficile et a augmenté le risque d'erreur d'étiquetage. Les échantillons de sein provenaient de trois patientes différentes et nous ont ainsi permis d'étudier l'aspect de généralisation par rapport à l'ensemble de données sur le foie, qui ne concernait qu'une seule patiente. Les spectres de la tumeur mammaire et des tissus sains sont similaires à ceux du foie et sont présentés à la Fig. 7.

Spectres mammaires prétraités (soustraction de base et normalisation vectorielle) des deux classes (rouge = tumeur, bleu = sain), y compris la distribution respective du signal de chaque longueur d'onde dans l'ensemble de données (ombres colorées). L'insertion en haut à droite montre une partie agrandie du spectre pour une meilleure visualisation de la raie Na.

L'attribution des raies et des bandes spectrales, ainsi que le prétraitement, la sélection du modèle et le réglage fin, ont été effectués de manière analogue à l'ensemble de données sur le foie. Les trois modèles optimisés (KNN, RF et ANN) fonctionnent à un niveau très élevé avec des scores CA cohérents supérieurs à 0,85 (KNN = 0,85, RF = 0,92 et ANN = 0,91) lorsque l'ensemble des spectres pour les trois patients est analysé.

Dans le sens de la généralisation, nous avons testé la capacité des algorithmes à classer correctement les nouvelles données provenant de patients inconnus. Dans le cadre de ce projet, nous avons utilisé l'ensemble de données des deux patients atteints de tumeurs primaires pour le processus de formation et testé la capacité des algorithmes à identifier la tumeur métastatique chez le troisième patient. Le pool d'apprentissage était composé de spectres des deux classes, tandis que l'ensemble de test ne contenait que des spectres de tissus tumoraux. Nous avons utilisé 1985 spectres de tumeur et 2558 spectres sains pour la phase d'entraînement, tandis que le test sur le nouveau patient a été effectué sur 1590 spectres de tumeur. La figure 8 affiche les résultats des classifications correctes des trois modèles.

Pourcentages de classifications correctes des métastases lorsque les algorithmes ont été entraînés sur des tumeurs primaires d'autres patients.

Le pourcentage de 99,9 (KNN et RF) et 99,7 (ANN) affiche un taux de prédiction étonnamment excellent et suggère un potentiel de généralisation. Cependant, étant donné que le groupe de formation était composé de deux patients et le groupe de test d'un patient avec des cellules cancéreuses du sein dans les ganglions lymphatiques, un plus grand groupe de patients est nécessaire pour des conclusions plus précises.

Il a été démontré que fs-LIBS peut être utilisé avec des échantillons très fins sur un substrat de verre de quartz et que le signal produit est suffisamment fort pour différencier les tissus hépatiques tumoraux des tissus sains avec une résolution spatiale élevée. Nous avons correctement identifié le type de tissu en utilisant un mélange de tranches LIBS et de référence adjacentes coupées au microtome. Les algorithmes Random Forest et Artificial Neural Networks ont obtenu les meilleurs résultats, classant correctement à la fois la tumeur et le tissu hépatique sain dans plus de 94 % des cas. Dans ce cas, l'algorithme K-Nearest Neighbor a produit une excellente identification du tissu tumoral mais a eu des résultats modestes dans le cas du tissu sain. En utilisant l'algorithme RF, l'importance des caractéristiques a été calculée, ce qui a conduit à la conclusion que les bandes moléculaires et la ligne de sodium sont prioritaires dans le processus de décision. La présence des raies moléculaires représente l'un des avantages de l'utilisation de lasers ultracourts, qui produisent une bonne signature spectrale après l'ablation avec des impulsions de faible énergie. Cela évite une dissociation massive du matériel biologique moléculaire comme dans le cas des impulsions laser ns, où la discrimination du type de tissu est basée uniquement sur les raies atomiques ou ioniques20,22,43. La possibilité d'utiliser cette technique chez une nouvelle patiente inconnue a été explorée sur des prélèvements mammaires avec une très bonne précision de classification.

À l'avenir, en plus d'augmenter le nombre de patients et d'étudier l'influence de la préparation de l'échantillon, nous souhaitons étudier la dépendance de la longueur d'impulsion pour la différenciation tissulaire. Afin d'augmenter encore la précision d'identification, parallèlement à l'amélioration du rapport signal sur bruit en utilisant des impulsions femtosecondes à double retard25, des algorithmes numériques plus complexes47 seront utilisés. Les applications possibles dans le domaine peropératoire devraient tenir compte de la disponibilité des sources laser, où les lasers à fibre à taux de répétition élevé avec des durées d'impulsion plus longues semblent prometteurs48 et peuvent également être facilement intégrés dans des dispositifs endoscopiques.

Nous nous attendons à ce que cette méthode puisse être utilisée in situ/in vivo comme méthode complémentaire à l'analyse pathologique standard.

Compte tenu de la précision spatiale de l'ablation avec des impulsions laser femtosecondes et du faible volume d'échantillon requis, nous pensons que des informations intra-chirurgicales sur la nature et l'étendue de la tumeur pourraient être obtenues après la formation des algorithmes d'identification sur des échantillons de biopsie du même patient. Dans un avenir lointain, lorsque les lasers fs pourront être utilisés comme outils chirurgicaux, cette méthode pourrait aider à distinguer les tissus sains des tissus malades directement lors de l'incision.

Les ensembles de données pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Les auteurs tiennent à remercier Sabrina Schuster, Andreea Cojocaru, Arne Ungeheur et le Dr Vladimir Gross de l'Université de Kassel pour leur aide dans l'amélioration de la configuration expérimentale et des méthodes d'analyse. PD Dr méd. Kia Homayounfar de Klinikum Kassel, Dr. med. Hannah Fahrner et le Dr rer. nat. Matthias Fahrner de l'Université de Fribourg, nous remercions pour des discussions utiles.

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL. Les auteurs déclarent qu'aucun financement externe n'a été utilisé.

Institut de physique, Université de Kassel, Heinrich-Plett-Str. 40, 34132, Cassel, Allemagne

Cristian Sarpe, Elena Ramela Ciobotea, Christoph Burghard Morscher, Bastian Zielinski, Hendrike Braun, Arne Senftleben & Thomas Baumert

Institut de pathologie Hesse du Nord, Germaniastr. 7, 34119, Cassel, Allemagne

Josef Ruschoff

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CS, ERC et CBM ont effectué les mesures et rédigé le manuscrit ; ERC, CBM et BZ ont analysé les données. Tous les auteurs ont contribué par des discussions critiques, lu et approuvé le manuscrit.

Correspondance à Thomas Baumert.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Sarpe, C., Ciobotea, ER, Morscher, CB et al. Identification du tissu tumoral dans des échantillons pathologiques minces via la spectroscopie de dégradation induite par laser femtoseconde et l'apprentissage automatique. Sci Rep 13, 9250 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36155-8

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Reçu : 23 janvier 2023

Accepté : 30 mai 2023

Publié: 08 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36155-8

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